Ο Γερμανός που έφτιαξε το πρώτο διαγνωστικό τεστ για τον κοροναϊό μιλά στο in.gr

Γράφει η Βάσω Μιχοπούλου

Η αποδοχή της πρόσκλησής μου από τον Δρα. Olfert Landt για μια τηλεφωνική επικοινωνία έφτασε στο μέιλ μου από το Βερολίνο στις 2:20 μετά τα μεσάνυχτα. Είναι η ώρα που ο 54χρονος ερευνητής παίρνει μια ανάσα από την καθημερινή 14-16ωρη βάρδια του στην TIB Molbiol Syntheselabor GmbH, την  δική του γερμανική εταιρεία βιοτεχνολογίας που, αυτή τη στιγμή, παράγει και τροφοδοτεί με διαγνωστικά τεστ του κορωνοϊού  ολόκληρο τον κόσμο. Διαθέτοντας μια 30χρονη εμπειρία στην ανάπτυξη διαγνωστικών τεστ για αναδυόμενες ασθένειες όπως το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS), η γρίπη των χοίρων, ή η γρίπη των πτηνών, ο εξειδικευμένος στην Μοριακή διαγνωστική Γερμανός Βιοχημικός ήταν ο πρώτος που εισήγαγε από τις αρχές Μαρτίου στην παγκόσμια κοινότητα, με την έγκριση του ΠΟΥ, ένα βιώσιμο διαγνωστικό τεστ του ιού SARS-CoV2 που ευθύνεται για την θανατηφόρα νόσο COVID-19.

Από την άλλη άκρη της τηλεφωνικής γραμμής ο ίδιος μού εξηγεί πως αυτή τη στιγμή η παραγωγή του έχει φτάσει στα 1,5 εκατομμύρια τεστ κορωνοϊού την εβδομάδα! Ο Landt εκτιμά ότι η εταιρεία του μέχρι σήμερα έχει παράγει περίπου 8 εκατομμύρια τεστ κορωνοϊού που πωλούνται συσκευασμένα σε κιτ. Κάθε κιτ περιλαμβάνει 100 τεστ και διοχετεύεται στην διεθνή αγορά μέσω πολυεθνικής προς τουλάχιστον 140-160 ευρώ το καθένα (δηλαδή το κάθε τεστ στοιχίζει περίπου 1,4-1,6 ευρώ!).

«Αυτή τη στιγμή έχουμε φτάσει στα όρια της δυναμικότητας μας και δυσκολευόμαστε πλέον να ανταποκριθούμε στις παραγγελίες μας. Περίπου τριάντα άτομα μαζί με την οικογένειά μου εργαζόμαστε καθημερινά περισσότερο από ένα 12ωρο», μού λέει ο ίδιος συμπληρώνοντας πως η βιολόγος σύζυγός του έχει αναλάβει την οικονομική διαχείριση της εταιρείας, ενώ ο γιός του που σπουδάζει Μαθηματικά και η ηθοποιός κόρη του έχουν αφήσει όλες τους τις δραστηριότητες για να συσκευάζουν τα κιτ σε πλαστικές σακούλες και να τοποθετούν επάνω τους τις ετικέτες.

«Είναι πολύ εύκολο να φτιάξεις ένα τεστ για τον κορωνοϊό…»

Με τα χρόνια, η TIB έχει δημιουργήσει τεστ για τη διάγνωση περισσότερων από 100 παθήσεων, χωρίς ωστόσο να έχει κατοχυρώσει κάποια πατέντα. Στην ερώτησή μου πόσο εύκολο είναι να δημιουργηθεί ένα διαγνωστικό τεστ για τον κορωνοϊό ο Δρ. Landt είναι σαφής: «Το πρώτο τεστ το φτιάξαμε μέσα σε μια βδομάδα, αλλά μπορεί να επιτευχθεί και νωρίτερα μέσα σε 1-2 μέρες». Και εδώ μου έρχεται η αυθόρμητη ερώτηση: αφού ένα τεστ για τον κορωνοϊό μπορεί να αναπτυχθεί ακόμη και μέσα σε ένα 24ωρο, γιατί μερικές χώρες αγωνίζονται να διαγνώσουν και να ταυτοποιήσουν το μέγεθος της διασποράς της νόσου; «Δυστυχώς δεν έχω απάντηση σε αυτό!», μου απαντά ο Γερμανός επιστήμονας.

Κάνοντας μια μικρή παρένθεση σχετικά με τα διαγνωστικά τεστ, ο Πρόεδρος του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας Κρήτης (ΙΤΕ), Διευθυντής Ερευνών στο Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας του ΙΤΕ, και Καθηγητής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Κρήτης, Νεκτάριος Ταβερναράκης εξηγεί πως: «οι 2 ευρέως χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για την ανίχνευση ιών που είναι μέλη της οικογένειας των κορωνοϊών όπως ο SARS-CoV2, είναι οι μοριακές τεχνικές που βασίζονται στην ανίχνευση του γενετικού υλικού του ιού, που για την κατηγορία των κορωνοϊών είναι RNA και όχι DNA, και οι ανοσολογικές που βασίζονται στην ανίχνευση αντισωμάτων που παράγει ο οργανισμός όταν μολύνεται με κορωνοϊό.

Στην πρώτη περίπτωση η ανίχνευση γίνεται με την μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), χρησιμοποιώντας ρινοφαρυγγικό επίχρισμα, και στη δεύτερη, χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος. Λόγω της υψηλής αστάθειας του γενετικού υλικού του ιού (RNA), τα μοριακά tests έχουν σχετικά περιορισμένη ακρίβεια, έτσι για παράδειγμα αντίστοιχα tests που χρησιμοποιούνται για τον ιό της γρίπης, έχουν ακρίβεια από 50% έως 80%, και μπορεί να αποτύχουν να ανιχνεύσουν τον ιό στα αρχικά στάδια της μόλυνσης. Από την άλλη, τα tests που βασίζονται στην ανίχνευση αντισωμάτων είναι χρήσιμα σε περιπτώσεις μόλυνσης με ελαφρά ή καθόλου συμπτώματα».

Προετοιμασία από την Πρωτοχρονιά…

Στις 31 Δεκεμβρίου 2019, το Γραφείο του ΠΟΥ στην Κίνα ενημερώθηκε για την εμφάνιση κρουσμάτων πνευμονίας άγνωστης αιτιολογίας στην πόλη Γουχάν της επαρχίας Χουμπέι της Κίνας. Έως τις 3 Ιανουαρίου 2020, είχαν αναφερθεί από τις Κινεζικές Αρχές συνολικά 44 ασθενείς, χωρίς να έχει εντοπιστεί ο λοιμώδης παράγοντας, ένα νέο είδος κορωναϊού, του SARS-CoV-2, ο οποίος και ταυτοποιήθηκε τελικά στις 7 Ιανουαρίου.

Σύμφωνα με μια αναφορά στο κινεζικό περιοδικό Caixin Global, η αλληλουχία του εν λόγω κορωναϊού ήταν γνωστή από τις 27 Δεκεμβρίου, ωστόσο οι Κινέζοι επιστήμονες την μοιράστηκαν με την διεθνή επιστημονική κοινότητα προκειμένου να προχωρήσει η ανάπτυξη διαγνωστικών κιτ στις 12 Ιανουαρίου 2020. Ο Δρ. Landt  μού εξηγεί πως άρχισε να κινητοποιείται λίγο μετά την Πρωτοχρονιά, όταν άκουγε στις ειδήσεις για μια παράξενη ασθένεια που εξαπλωνόταν στην Κίνα. Παρότι βασική προϋπόθεση για την δημιουργία ενός διαγνωστικού τεστ για έναν νέο ιό είναι η αναγνώριση της αλληλουχίας του γενετικού του υλικού, αυτή τη φορά, ο Olfert Landt ξεκίνησε πολύ νωρίς παρακάμπτοντας αυτό το στάδιο και μέχρι τις 9 Ιανουαρίου είχε σχεδιάσει το πρώτο κιτ με τη χρήση τεχνολογίας συνθετικών νουκλεϊνικών οξέων και έχοντας ως αναφορά άλλους γνωστούς κορωνοϊούς που έχουν στενή γενετική συγγένεια με τον SARS-CoV του 2003, δηλ. τον ιό που προκαλεί το οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS).

«Γνωρίζαμε ότι επιστήμονες εργάζονταν στην Κίνα για να αποκρυπτογραφήσουν το RNA του νέου ιού. Ωστόσο μέχρι τη δημοσίευσή της γενετικής ακολουθίας του ιού από τον Zhang Yongzhen, καθηγητή του Πανεπιστημίου Fudan της Σαγκάης στις 12 Ιανουαρίου τα χέρια μας ήταν δεμένα», συμπληρώνει ο ερευνητής.

Ο Δρ.Landt προμηθεύτηκε δείγματα από ιικές κυτταροκαλλιέργειες από το εργαστήριο του Christian Drosten, του Ινστιτούτου Ιολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Charité του Βερολίνου και από το πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ και σχεδίασε τρία διαγνωστικά κιτ για να μπορεί να επιλέξει το καταλληλότερο μετά την δημοσίευση της γενετικής ακολουθίας του κορωνοϊού. Στις 17 Ιανουαρίου, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (WHO) δημοσιοποίησε online το πρωτόκολλο του Landt, ενώ ο Γερμανός ερευνητής μαζί με ακαδημαϊκούς συνεργάτες από την Ευρώπη και το Χονγκ Κονγκ, δημοσίευσε λεπτομέρειες σχετικά με το διαγνωστικό τεστ.

Στις 23 Ιανουαρίου το τεστ λειτούργησε αποτελεσματικά ανιχνεύοντας τον SARS-CoV-2 του κορωνοϊού και διακρίνοντας τον από τον SARS-CoV του οξέος αναπνευστικού συνδρόμου. Η αποτελεσματικότητά του επιβεβαιώθηκε σε 297 κλινικά δείγματα ασθενών με διάφορες άλλες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος. Αυτό αποτέλεσε και τη βάση της πρώτης αποστολής 250.000 κιτ, τα οποία ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) διοχέτευσε σε 159 εργαστήρια σε ολόκληρο τον κόσμο τις επόμενες εβδομάδες.

Πώς λειτουργεί το τεστ της TIB Molbiol

Το τεστ της TIB Molbiol βασίζεται στην μοριακή μέθοδο PCR, τα αρχικά της οποίας προέρχονται από τις λέξεις Polymerase Chain Reaction (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), για ανίχνευση του DNA ενός παθογόνου μικροοργανισμού.

Στην περίπτωση ενός RNA ιού, όπως εν προκειμένω στον κορωνοϊό, προηγείται του PCR μια αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε DNA. «Η δοκιμασία PCR λειτουργεί με την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης γενετικής ακολουθίας (τμημάτων γενετικού υλικού) στον ιό με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers) Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτίδια 18-30 βάσεων που οριοθετούν το τμήμα του γονιδιώματος (αλληλουχία στόχος) που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, ώστε o ιός να μπορεί να ανιχνευθεί πριν από την εμφάνιση των συμπτωμάτων. Αλλά η PCR μπορεί να ανιχνεύσει τον ιό μόνο αν είναι παρών σε ένα άτομο.

Δεν αποκαλύπτει πολλά για μια λοίμωξη που έχει περάσει. Κατά τη διάρκεια μιας τυπικής αντίδρασης PCR το επιθυμητό τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιάζεται μέχρι και ένα δισεκατομμύριο φορές, γεγονός που είναι απαραίτητο για μετέπειτα χειρισμούς, όπως η ηλεκτροφόρηση, η πέψη με ένζυμα περιορισμού, η ανάγνωση της αλληλουχίας βάσεων κ.ά.», εξηγεί ο επιστήμονας. Η PCR είναι μια διαγνωστική μέθοδος που συνιστάται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ). Είναι μια εξαιρετικά επιλεκτική και ευαίσθητη μέθοδος με δυνατότητα ανίχνευσης ακόμη και ενός μοναδικού μορίου DNA σε ένα μείγμα. Μικροποσότητες RNA μπορούν επίσης να αναλυθούν με τον ίδιο τρόπο. Με το τεστ του Δρα. Landt είναι ανιχνεύσιμα τουλάχιστον πέντε μόρια γενετικού υλικού: «Το κάθε σετ είναι πολύ ελαφρό, ζυγίζει περίπου 14 γραμμάρια και περιλαμβάνει δύο φιαλίδια: ένα που περιέχει το primer (εκκινητή) για την ανίχνευση μιας λοίμωξης και ένα συνθετικά κατασκευασμένο κομμάτι του ιού, δηλαδή το επονομαζόμενο θετικό control.

Προκειμένου να διαπιστωθεί αν το τεστ όντως είναι λειτουργικό και ανιχνεύει τον ιό, παρέχεται ένα συνθετικά φτιαγμένο τμήμα του γενετικού υλικού του ιού, ώστε να δοκιμαστεί το kit. Χρησιμοποιώντας αυτό το δείγμα ως θετικό διαπιστώνεται αν όντως το τεστ ανιχνεύει το γενετικό υλικό του ιού. Ένας βιολόγος συνδυάζει τα συστατικά του kit με ένα ρινοφαρυγγικό επίχρισμα ασθενούς, που συνήθως έχει ληφθεί με ειδικό στυλεό.

Η διαδικασία της ανίχνευσης, έως ότου ληφθεί το αποτέλεσμα, απαιτεί δύο ώρες το μέγιστο». Ρωτάω τον Γερμανό επιστήμονα πώς μπορεί να προβλέψει πιθανές μεταλλαγές του ιού και μου απαντά πως η ομάδα του μελετά σε καθημερινή βάση όλες τις δημοσιεύσεις σχετικά με το γονιδίωμά του: «Στατιστικά με τις περίπου 29.000 βάσεις που περιέχει το RNA του ιού, αναμένονται 1/1000 αλλαγές σε ένα μήνα, δηλαδή μια μεταλλαγή σε 20 εβδομάδες. Είναι αρκετός χρόνος για επαναξιολόγηση των δυνατοτήτων του τεστ. Το plan B είναι η προσαρμογή στα PCR για το SARS-CoV-2 διαφορετικών εκκινητών που στοχεύουν διαφορετικά τμήματα της γενετικής αλληλουχίας του ιού».

Η ΤΙΒ Molbiol και στην Ελλάδα

Η εταιρεία βιοτεχνολογίας του γερμανού βιοχημικού διαθέτει εγκαταστάσεις σε αρκετές χώρες της Ευρώπης, στην Ισπανία, στην Ιταλία, στην Πολωνία και αλλού, οι οποίες εν καιρώ κορωνοϊό προωθούν τα δικά της kit με τα διαγνωστικά τεστ. Ο Olfert Landt μού ξεκαθαρίζει πως τα kit που παράγει η εταιρεία του διοχετεύονται παγκοσμίως μόνο σε δημόσια και ιδιωτικά εργαστήρια που μπορούν να τα «τρέξουν», δηλαδή που διαθέτουν τον κατάλληλο εξοπλισμό και την τεχνογνωσία για να τα εφαρμόσουν. Τα τεστ της γερμανικής εταιρείας φτάνουν και στην Ελλάδα μέσω μεγάλης πολυεθνικής, αλλά ο ίδιος δεν μπορεί να μου πει με βεβαιότητα αν είναι αυτά που χρησιμοποιούνται από το εθνικό σύστημα υγείας ή περιορίζονται στα ιδιωτικά διαγνωστικά εργαστήρια.

Μερικές φορές τα τεστ παράγουν ψευδή θετικά αποτελέσματα εάν τα αντιδραστήρια σε ένα εργαστήριο μολυνθούν. Αυτό εξηγεί γιατί κάποιοι άνθρωποι που αναρρώνουν από την ασθένεια δείχνουν αρνητικό το τεστ και στη συνέχεια θετικό. Από τη στιγμή που ένας βιοτεχνολόγος αποσπά το ιικό γενετικό υλικό από το δείγμα για να παραγάγει χιλιάδες αντίγραφα μέχρι να πάρει ένα μετρήσιμο αποτέλεσμα, η διαδικασία απαιτεί λεπτούς χειρισμούς.

Η δοκιμή PCR είναι αρκετά ευαίσθητη. Η κύρια διαφορά από το ένα κιτ στο άλλο είναι το τμήμα του γονιδιώματος (αλληλουχίες -στόχοι) του κορωνοϊού κάθε δοκιμής. Τα εγκεκριμένα από το CDC (Centers for Disease Control and Prevention) τεστ στοχεύουν τις περιοχές γονιδίων που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη που δημιουργεί το νουκλεοκαψίδιο του ιού, δηλαδή, ένα φάκελο που περικλείει το RNA του (προκειμένου για υπενδεδυμένο ιό).

Σύμφωνα με το επιστημονικό περιοδικό Nature, το πρωτόκολλο του τεστ του Landt είναι κατάλληλο μόνο για μεγάλα συγκεντρωτικά διαγνωστικά εργαστήρια (π.χ. του Ινστιτούτου Παστέρ ή μερικών πανεπιστημίων στην Ελλάδα). Μπορεί να χρειάζεται λίγες ώρες για να ολοκληρωθεί, αλλά περνάει αρκετός χρόνος, 24 έως 48 ώρες (καμιά φορά και περισσότερο) μέχρι να μεταφερθούν τα δείγματα στα εργαστήρια από τα νοσοκομεία και να γνωστοποιηθούν τα αποτελέσματα. Γι’ αυτό άρχισαν, ήδη, να αναπτύσσονται σε διάφορες χώρες δεκάδες γρήγορα επιτόπια φορητά τεστ (Rapid ή Point-of-Care Tests-POC), οικιακές (in house) τεχνικές realtime PCR με τη χρήση των νέου τύπου στυλεών “flocked swabs” με πολύ καλά αποτελέσματα των οποίων η μαζική παραγωγή και κυκλοφορία είναι θέμα χρόνου.

Αυτό επιβεβαιώνει και ο Καθηγητής Ταβερναράκης: «Γίνεται προσπάθεια στην Αμερική και αλλού να αναπτυχθούν οικιακά tests, τα οποία θα επιτρέπουν τη λήψη δειγμάτων στο σπίτι και στη συνέχεια την αποστολή τους σε εξειδικευμένα εργαστήρια, όπου θα γίνεται η ανάλυση. Αν και κάποιες εταιρείες ήδη προσφέρουν τέτοια kits για οικιακή χρήση, δεν είναι προς το παρόν επιβεβαιωμένη η αξιοπιστία τους. Γίνονται όμως μεγάλες προσπάθειες σε όλο τον κόσμο, για την ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων, οι οποίες θα μπορούν με ταχύτητα και ακρίβεια να ανιχνεύουν τον SARS-CoV2 και είναι σχεδόν βέβαιο ότι στους επόμενους μήνες θα δούμε κάποιες από τις μεθόδους αυτές να χρησιμοποιούνται ευρέως στο πεδίο».

Πηγές:

https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200121-sitrep-1-2019-ncov.pdf

https://www.nature.com/articles/d41587-020-00010-2

https://www.gisaid.org/

http://virological.org/t/novel-2019-coronavirus-genome/319